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　　貼壁細胞培養(yǎng)常見問題分析及解決方法!
 

　　貼壁細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)(瓶)器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生。貼壁細胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣，所以培養(yǎng)時更容易出現(xiàn)問題。BUNSEN本生小編總結(jié)了貼壁細胞培養(yǎng)中常見問題，并詳細介紹原因和解決方法，若培養(yǎng)時遇到這些情況，可參考對應解決方法處理。

　　一、貼壁細胞培養(yǎng)，細胞不貼壁

　　常見原因：胰蛋白酶消化過度;支原體污染;培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解);細胞老化;接種細胞起始濃度太低或太高。

　　解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度;分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物;使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2;啟用新的保種細胞;調(diào)節(jié)接種細胞濃度。

　　二、培養(yǎng)細胞生長緩慢

　　常見原因：由于更換不同培養(yǎng)液或血清;培養(yǎng)液中一些細胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞;培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染;試劑保存不當;接種細胞起始濃度太低;細胞已老化;支原體污染。
 

　　解決方法：比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液;換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子;用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物;血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完;增加接種細胞起始濃度;換用新的保種細胞;分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　三、細胞生長周期變慢，邊養(yǎng)邊漂

　　常見原因及解決方法：

　　1、細胞傳代時密度太稀或太密：建議細胞密度達80%左右進行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期;

　　2、傳代操作不當：根據(jù)細胞特性決定細胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化，難消化的細胞可分次消化，每次時間不超過5min;頻繁換液或者清洗細胞也會導致細胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時間間隔為2~3天。

　　四、傳代后部分細胞漂浮

　　常見原因及解決方法：

　　1、傳代細胞密度太大：一般細胞匯合度達到80%時可進行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導致傳代后漂浮;

　　2、細胞狀態(tài)不好：可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進行改善;

　　3、吹打次數(shù)過多造成機械損傷：輕柔吹打，細胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產(chǎn)生;

　　4、培養(yǎng)基更換后不適應：更換回原來的培養(yǎng)基;或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細胞有個適應期。

　　五、傳代后細胞全部飄起

　　解決方法：檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色，檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。

　　通常培養(yǎng)基偏堿，顏色就會偏紫，主要是因為培養(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養(yǎng)基量太少，或培養(yǎng)基存放時間太長時都會變堿。建議配好培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完，量少時放到15mL離心管里保存。

　　六、傳代后細胞成團

　　解決方法：

　　1、低密度接種，延長換液時間，防止細胞脫落;

　　2、使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細胞貼壁牢固度，降低細胞聚集成團的幾率;

　　3、重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例(增加比例不超過5%);

　　4、接種時，減少培養(yǎng)基量(如T25加3mL)以加快細胞貼壁速度，等待細胞貼壁后(約8-12小時)，再補加培養(yǎng)基到正常用量。

　　七、傳代后細胞變形

　　原因及解決方法如下

　　1)變形，但細胞還在生長：可能是血清批次不一樣導致，血清成分復雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細胞有過渡期;

　　2)變形，但細胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當，或者潛在支原體等污染導致細胞病態(tài);消化時間根據(jù)每個細胞的狀態(tài)來調(diào)整，消化過度或者消化不充分均會對細胞造成影響;培養(yǎng)過程應嚴格無菌操作，實驗環(huán)境盡量潔凈，確保細胞無外源污染。

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